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2023-12-11 04:32 作者：岑岑围观：次

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作者:幸运王(本文由读者投稿，请注意:解套博士研究助手)

这期本来是想解释一篇30多分性质的论文。后来我想，只有高富帅(丹尼尔的导师，一个好的实验室，充足的资金，以及聪明和有上进心)才能吸引这么有钱的美女。于是，在4.652的傻逼学习下，小博士&；小青椒一年舔两片就够了。

本文标题为:在LPS刺激诱导的结肠癌细胞模型中，通过增加NF-κB与VEGDR-3启动子的结合机制，上调VEGDR-3的表达，从而促进细胞迁移和侵袭(回复“0328”可下载文档)。

一.实验假设

免疫组织化学法观察结肠癌患者临床标本中VEGFR-3的表达。发现VEGFR-3在邻近组织和正常结肠直肠粘膜细胞中不表达或表达水平很低(图. 1a)。VEGFR-3在结直肠癌中的表达为阳性或高水平(图1 B)。因此，VEGFR-3的表达可能促进结肠癌的发展。

第二，结果的解释

表2临床数据VEGFR-3在结直肠癌组织和正常结直肠组织中的表达。* P & lt0.05

表2

/图像-3/图1

建立体外细胞模型:用LPS刺激sw480和HCT116结肠细胞系，用q PCR和WB法检测VEGFR-3的mRNA和蛋白表达。

图2a & amp；B:B:SW 480和HCT116细胞中VEGFR-3的mRNA和蛋白表达水平相似。

图2c & amp；d:脂多糖刺激sw480细胞VEGFR-3 mRNA和蛋白的表达，并随脂多糖剂量的增加而增加；

图2e & amp；F: LPS刺激HCT116细胞中VEGFR-3 mRNA和蛋白的表达，并随LPS剂量的增加而增加。

成功建立了两种结肠癌细胞模型。

图2

在LPS诱导的细胞模型中，VEGFR-3在促进细胞迁移和侵袭中起着非常重要的作用。图3 (a-d)细胞增殖试验，sw480和HCT116的LPS处理不影响细胞增殖。用Transwell法检测LPS诱导的细胞模型sw480和HCT116的迁移和侵袭能力:图3(e & F)模型组(LPS刺激)的细胞迁移和侵袭总数明显高于正常组(不加LPS)；模型组加入VEGFR-3抗体IgG(LPS-800ng-IgG)阻断其生物活性，细胞迁移和侵袭总数明显下降。这表明VEGFR-3参与了细胞迁移和侵袭的过程。

图3

图4(A)蛋白印迹实验显示LPS受体TLR4蛋白在模型组中表达。

图4(B)与正常组相比，模型组NF-κB的表达水平无明显差异。p-NF-κB的表达显著增加。

LPS通过TLR4受体激活NF-κB。

图4

构建了一系列VEGFR-3基因启动子5’端部分缺失的载体，并转染到细胞系中。

图5 (A)将含有不同VEGFR-3启动子片段的质粒转染到细胞PGL3B-1659中...PGL3B-59和pGL3-Basic(无启动子，对照)，质粒是肾素荧光素酶表达载体pRL-TK。pGL3B-1659、pGL3B-1159、pGL3B-834、pGL3B-609、pGL3B-334和pGL3B-159的荧光强度显著高于pGL3B-59和pGL3B-Basic。与pGL3B-1659(全长启动子)相比，pGL3B-159具有更高的荧光素酶活性，表明从-159碱基到+65碱基的区域是具有VEGFR-3启动子活性的重要区域。选择质粒pGL3B-159用于下一步研究。pGL3B-59质粒转染细胞的荧光素酶活性远低于pGL3B-159，这表明VEGFR-3启动子中的这个区域(-159nt至-59nt)起重要作用。利用生物信息学软件，作者认为该区域可能是转录因子的结合位点。

图5(b)VEGFR-3启动子的部分核苷酸序列，从-137碱基到-128碱基，是NF-κ B的结合位点。

图5(C)突变VEGFR-3启动子序列中的NF-κB结合位点以构建pGL3B-159-mut质粒。与未突变的质粒pGL3B-159-mut相比，结合位点的突变导致VEGFR-3启动子活性下降约40%。结果表明，NF-κB的结合位点对pGL3B-159质粒的活性至关重要。

图5(D & amp；E)LPS处理显著提高了pGL3B-159质粒的活性，且呈浓度依赖性。

图5

为了验证NF-κB在VEGFR-3启动子活性中的作用，构建了过表达载体PcDNA3.0-NF-κB和基因沉默载体siRNA-NF-κB。在PcDNA3.0-NF-κB超声表达组中，NF-κB的表达显著增加(图6 (a))。在siRNA-NF-κB组，NF-κB的表达显著降低(图6(C))。

PcDNA3.0-NF-κB质粒和siRNA-NF-κB质粒分别共转染sw480细胞，检测荧光强度:NF-κB超声表达组(PcDNA3.0-NF-κB)的荧光强度明显高于对照组，NF-κB的过表达增加了VEGFR-3启动子的活性(图6 (b))。小RNA干扰组(siRNA-NF-κB)荧光强度显著下降，VEGFR-3启动子活性下降(图6(D))。

将过表达质粒(pcDNA3.0-NF-κB)分别与pGL3B-159和pGL3B-159-mut(NF-κB结合位点突变)共转染。随着pcDNA3.0-NF-κB浓度的增加，pGL3B-159组的荧光增加，并呈现剂量依赖性图6(E)，而pGL3B-159-mut组则没有。结果表明，VEGFR-3启动子的活性与NF-κB呈浓度依赖关系。