铁死亡的研究进展，铁死亡临床

2023-12-11 04:32 作者：岑岑围观：次

二运一个专门搞科研的团队。

原来魏一个研究显微镜的人关注我们。

铁下垂是一种新的细胞死亡方式，具有铁依赖性和脂质过氧化物的积累，与肿瘤的发生、发展和耐药性密切相关。铁死自发现以来，自行掀起了研究狂潮，成为医学研究领域的热门研究方向，也是近年来国家自然基金的热门资助项目。

今天魏给大家分享一个“9+”铁死文档的思路，教大家铁死Das实验的设计。

文献信息

标题:西妥昔单抗通过抑制KRAS突变型结直肠癌中Nrf2/HO-1信号通路促进RSL3诱导的铁下垂(西妥昔单抗通过抑制Kras突变型结直肠癌中NRF 2/HO-1信号通路促进RS L3诱导的铁死亡)。

杂志:细胞死亡和疾病(IF: 9.865)

研究设计

1.研究西妥昔单抗对氯化亚砜对KRAS突变型大肠癌细胞毒性的影响。

四种KRAS突变CRC细胞系(HCT116、DLD-1、LOVO和SW480)用单独的RSL3或与西妥昔单抗组合处理24小时，以研究药物对细胞存活率的影响。根据存活率的结果，选择HCT116和DLD-1细胞用于随后的实验。研究RSL3、西妥昔单抗及其联合作用24h对两种细胞存活率、形态变化和集落形成能力的影响。

2.研究西妥昔单抗对KRAS突变型结直肠癌细胞中三氯化锶诱导的铁死亡的影响。

为了研究RSL3和西妥昔单抗是否能促进铁死亡，在KRAS突变株HCT116和DLD-1细胞中评估了与铁死亡相关的指标，即脂质活性氧(ROS)的积累、丙二醛(MDA)的水平和细胞内铁水的均一性。此外，将铁死亡抑制剂Fer-1、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、坏死抑制剂necrostatin-1或自噬抑制剂3-MA加入细胞中，以研究哪些抑制剂可以抑制用RSL3和西妥昔单抗处理的HCT116和DLD-1细胞的生长。

3.研究RSL3和西妥昔单抗联合治疗对KRAS突变肾细胞癌Nrf2/HO-1轴的影响。

Keap1是细胞对氧化应激反应的主要调节因子。氧化应激后，Keap1与Nrf2分离，导致Nrf2积累、核易位和靶基因HO-1转录激活。因此，在本研究中，首先研究了RSL3和西妥昔单抗联合治疗对Keap1、Nrf2、HO-1和其他蛋白质的影响。然后敲除Nrf2以评估Nrf2表达对经西妥昔单抗和RSL3治疗的CRCs存活率和铁死亡相关指标的影响。

4.研究西妥昔单抗是否通过激活p38 MAPK来调节Nrf2/HO-1轴。

为了研究p38 MAPK在Nrf2/HO-1表达中的作用，评估了西妥昔单抗和SB 202190(p38的特异性抑制剂)对HCT116和DLD-1细胞中P38活性和Nrf2和HO-1表达的影响。研究RSL3、西妥昔单抗和SB202190对细胞存活率的影响。然后，在两种细胞中过表达Nrf2或HO-1，并研究Nrf2或HO-1表达对用西妥昔单抗和RSL3处理的细胞存活率的影响。

5.研究西妥昔单抗在体内是否能促进三氯化锶诱导的铁死亡。

建立异种移植裸鼠模型，探讨西妥昔单抗是否能促进体内三氯化锶诱导的铁死亡。研究RSL3、西妥昔单抗及其组合对肿瘤重量、肿瘤大小、肿瘤体积和重量的影响。体内MDA水平；以及Nrf2、HO-1和Keap1蛋白水平的影响。

主要结果

1.西妥昔单抗增强RSL3治疗对KRAS突变CRC细胞的细胞毒性。

发现西妥昔单抗治疗增强了RSL3对HCT116和DLD-1细胞的细胞毒性(图1A，B)。与RSL3或西妥昔单抗治疗相比，RSL3和西妥昔单抗的联合治疗显著抑制了细胞增殖(图1C)。表明西妥昔单抗治疗可显著抑制细胞活力和增殖，并增强RSL3对KRAS突变型CRC细胞系的细胞毒性。

图1西妥昔单抗增强RSL3对KRAS突变型CRC细胞的细胞毒性。

2.西妥昔单抗增强KRAS突变型结直肠癌细胞中RSL3诱导的铁死亡。

脂质过氧化探针C11-BODIPY581/591用于检测细胞内脂质ROS的水平。研究发现，在联合治疗RSL3和西妥昔单抗后，脂质ROS的累积显著增加(图2A)并且MDA的水平显著增加(图2B)。西妥昔单抗不影响HCT116或DLD-1细胞系中脂质ROS和MDA水平的积累，但增强了由RSL3诱导的脂质ROS和MDA水平的增加(图2B)。此外，与单独用RSL3处理相比，用RSL3结合西妥昔单抗处理的细胞发出更强的橙色荧光(图2C)。此外，RSL3和西妥昔单抗治疗增加了HCT116和DLD-1细胞的生长抑制，这种抑制被铁死亡抑制剂Fer-1逆转(图2D)。这些结果表明，西妥昔单抗可以增强KRAS突变型结直肠癌细胞系中由RSL3诱导的铁死亡。

图2西妥昔单抗治疗可以增强KRAS突变型CRC细胞中由RSL3诱导的铁死亡。

3.用RSL3和西妥昔单抗联合治疗可以抑制KRAS突变的CRCs中的Nrf2/HO-1轴。

蛋白质印迹分析显示，在RSL3和西妥昔单抗治疗后，Keap1表达增加，Nrf2/HO-1信号转导被抑制(图3A)。在HCT116和DLD-1细胞中，siRNA转染48 h可以降低Nrf2及其下游靶HO-1的表达。与RSL3组相比，用RSL3处理的转染组中Nrf2和HO-1的水平下降(图3B)。靶向Nrf2的siRNA转染可以提高HCT116和DLD-1细胞对RSL3的敏感性(图3C)。此外，Nrf2敲除增加了由RSL3诱导的MDA水平(图3D)，细胞内脂质ROS水平(图3E)和细胞内铁积累(图3F)。这些结果表明RSL3和西妥昔单抗的联合治疗可以抑制KRAS突变型CRC细胞中的Nrf2/HO-1信号。

图3用RSL3和西妥昔单抗的组合治疗可以抑制KRAS突变型CRC细胞中的Nrf2/HO-1轴。

4.西妥昔单抗激活p38 MAPK并调节Nrf2/HO-1轴。

用西妥昔单抗或SB202190处理的细胞中p38蛋白的水平与对照组中的没有不同。西妥昔单抗显著增加了p-p38的水平，但当西妥昔单抗与SB202190联合使用时，这种影响被消除(图4A)。此外，西妥昔单抗治疗降低了Nrf2和HO-1的表达，而SB202190降低了西妥昔单抗介导的Nrf2和HO-1的抑制作用(图4A)。此外，SB202190部分挽救了由RSL3和西妥昔单抗诱导的HCT116和DLD-1细胞的死亡(图4B)。此外，Nrf2或HO-1的过表达逆转了西妥昔单抗和RSL3联合治疗对CRC细胞存活率的抑制作用(图4D-F)。此外，通过t-BHQ处理激活Nrf2或通过氯化血红素处理激活HO-1部分逆转了RSL3和西妥昔单抗处理对HCT116和DLD-1细胞的生长抑制(图4G，H)。这些结果表明p38 MAPK参与调节Nrf2和HO-1的表达，西妥昔单抗可以通过激活p38 MAPK抑制Nrf2/HO-1通路。

图4西妥昔单抗激活p38 MAPK并调节Nrf2/HO-1轴。

5.在异种移植裸鼠模型中，西妥昔单抗通过抑制KRAS突变的CRCs中的Nrf2/HO-1轴增强由RSL3诱导的铁死亡。

在DLD-1异种移植裸鼠模型中，单独使用RSL3以及西妥昔单抗和RSL3联合治疗均可缩小肿瘤大小，且联合治疗组肿瘤大小的缩小最大(图5B-D)。对照组和治疗组之间的体重和每日食物摄入量没有显著变化(图5E)。然后我们测试了西妥昔单抗联合RSL3是否能在体内调节脂质过氧化。值得注意的是，组合组中MDA的浓度水平显著增加(图5F)。蛋白质印迹显示，在RSL3和西妥昔单抗共同治疗后，Nrf2和HO-1的相对水平下降，keap1的表达增加(图6A)。免疫组织化学染色也证实，在用RSL3和西妥昔单抗共治疗后，Ki67、Nrf2和HO-1低表达，keap1高表达(图6B)。这些体内结果证实了西妥昔单抗通过抑制Nrf2/HO-1活化增强了由RSL3诱导的铁死亡。